干細(xì)胞是一類(lèi)具有無(wú)限的或者永生的自我更新能力的細(xì)胞、能夠產(chǎn)生至少一種類(lèi)型的、高度分化的子代細(xì)胞[1]。

干細(xì)胞被認(rèn)為可以提供一種理想的生物學(xué)平臺(tái), 用于多方面的科學(xué)研究與臨床應(yīng)用, 如藥物篩選平臺(tái)的建立、細(xì)胞發(fā)育與分化的分子調(diào)節(jié)機(jī)制研究、基因靶向敲除動(dòng)物模型的構(gòu)建、組織工程種子細(xì)胞及基因治療載體的建立、細(xì)胞治療及再生醫(yī)學(xué)等[2]。

干細(xì)胞研究離不開(kāi)干細(xì)胞的培養(yǎng)。合格的干細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程，包括促進(jìn)其分裂增殖和維持其未分化狀態(tài)。

基于以上兩點(diǎn)要求，目前主流的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法為飼養(yǎng)層培養(yǎng)法：

即在有絲分裂失活的飼養(yǎng)層細(xì)胞 (FEEDER) 上培養(yǎng)干細(xì)胞。培養(yǎng)體系一般為高糖DMEM，添加適量的胎牛血清 (FCS) 及白血病抑制因子 (LIF)、L-谷氨酰胺等添加劑。

另外，為了避免外源性物質(zhì)的干擾（如血清、病原等成分）[3]，又嘗試及建立了其他培養(yǎng)基, 包括條件培養(yǎng)基 (CM) 、無(wú)飼養(yǎng)層、無(wú)血清、血清替代物 (SR) 非條件培養(yǎng)基等。

其中無(wú)血清培養(yǎng)基中添加了更多珍貴的細(xì)胞因子，而血清替代物培養(yǎng)基則采用人工/半人工合成分子替代物的形式，來(lái)替代血清，成本相較于普通胎牛血清*培養(yǎng)基而言，高出不少。

01

飼養(yǎng)層培養(yǎng)法

目前認(rèn)為，飼養(yǎng)層能夠提供干細(xì)胞接觸所必需的復(fù)雜蛋白分子。自1981年EVANS等人[4]用飼養(yǎng)層成功培養(yǎng)了mESC起，飼養(yǎng)層培養(yǎng)法便開(kāi)始不斷發(fā)展。實(shí)驗(yàn)過(guò)程，主要分為以下三步：配制飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)基、準(zhǔn)備飼養(yǎng)層細(xì)胞、配制飼養(yǎng)單層細(xì)胞培養(yǎng)基、飼養(yǎng)單層制備、配制干細(xì)胞培養(yǎng)基、接種干細(xì)胞培養(yǎng)。

飼養(yǎng)層培養(yǎng)法卻存在著不可避免的缺點(diǎn)：

1、 飼養(yǎng)層細(xì)胞生命期有限，不能在體外長(zhǎng)期傳代。在體外傳代時(shí)間太長(zhǎng)，其產(chǎn)生促增殖因子和抑制分化因子的能力會(huì)減弱甚至喪失。

2、 MEF細(xì)胞的染色體干擾：飼養(yǎng)層細(xì)胞會(huì)影響干細(xì)胞遺傳物質(zhì)。　

3、 絲lie霉素-C的影響：飼養(yǎng)層細(xì)胞需要用到絲lie霉素-C，該物質(zhì)可能會(huì)影響干細(xì)胞的增殖。

4、 異種抗原及污染的影響：飼養(yǎng)層細(xì)胞作為異種抗原也會(huì)影響干細(xì)胞的健康，還有發(fā)生細(xì)胞間融、引入其他動(dòng)物源性病原體，給臨床移植治療帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。

5、 所用試劑復(fù)雜，批次不可控：所用材料的批次之間的波動(dòng)，限制了培養(yǎng)物之間的可重復(fù)性。

6、 實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，培養(yǎng)基配制復(fù)雜：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加例如白血病抑制因子（LIF）[6]這樣的多功能細(xì)胞因子，但無(wú)論進(jìn)口還是國(guó)產(chǎn)的產(chǎn)品，都不免有價(jià)格高昂的缺點(diǎn)。而自己配制，又會(huì)面臨操作繁瑣、易污染等問(wèn)題。飼養(yǎng)層培養(yǎng)從培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞開(kāi)始，至少需要一周時(shí)間才能得到所需的干細(xì)胞，周期過(guò)長(zhǎng)。

/////

02

無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)

無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)類(lèi)似普通細(xì)胞培養(yǎng)，主要分為以下幾個(gè)步驟：培養(yǎng)瓶預(yù)處理、配制培養(yǎng)基、消化/復(fù)蘇干細(xì)胞、接種、培養(yǎng)。

相較于飼養(yǎng)層培養(yǎng)法，無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)顯而易見(jiàn)：更加簡(jiǎn)便、節(jié)省時(shí)間；但缺點(diǎn)也十分明顯：

1、 培養(yǎng)的細(xì)胞質(zhì)量不穩(wěn)定：由于自行配制的培養(yǎng)基，不可控因素較多，缺少營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞對(duì)的存在，干細(xì)胞生長(zhǎng)狀況也不穩(wěn)定，直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2、 成本高昂：商品化的培養(yǎng)基，根據(jù)品質(zhì)不同，價(jià)格也是從幾百元到幾千元不等，直接增加了干細(xì)胞的培養(yǎng)成本。

3、 需要不斷對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行調(diào)整，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員有很高的要求：無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)法需要人為添加各種各樣的細(xì)胞因子，不同的干細(xì)胞還需要進(jìn)行細(xì)微的調(diào)整以適應(yīng)不同的生長(zhǎng)需求，因此培養(yǎng)難度更高，對(duì)技術(shù)人員的操作水平及經(jīng)驗(yàn)有很高的要求